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Revista de Saúde Pública

Print version ISSN 0034-8910

Rev. Saúde Pública vol.14 n.1 São Paulo Mar. 1980

http://dx.doi.org/10.1590/S0034-89101980000100004 

Infecção experimental de Lymnaea columella por Fasciola hepatica

 

Laboratory infection of Fasciola hepatica in Lymnaea columella

 

 

Marlene Tiduko Ueta

Do Departamento de Parasitologia do Instituto de Biologia da UNICAMP — Caixa Postal 1170 — 13100 — Campinas, SP — Brasil

 

 


RESUMO

Os ovos de F. hepatica recolhidos em bilis de boi, fezes e em bilis de coelhos foram incubados a temperatura ambiente, dando origem a miracídios após 9 a 13 dias. Com estes miracídios recém-eclodidos foram infectados experimentalmente 233 exemplares de L. columella medindo 5,0 a 11,0 mm de comprimento. Das limneas infectadas apenas 3% sobreviveram até o desenvolvimento completo das cercarías. Houve formação de 190 a 1150 metacercárias entre o 46° ao 54° dia de infecção. Vários camundongos, ratos, cobaias e coelhos foram infectados com metacercárias de diferentes idades, mas somente os coelhos eliminaram ovos nas fezes 78 dias depois. Com a morte dos coelhos foram recuperados vermes adultos.

Unitermos: Infecção de laboratório. Fasciola hepatica. Lymnaea columella.


ABSTRACT

F. hepatica eggs from infected cattle and rabbits were incubated at room temperature, hatching miracidia within 9 to 13 days. Newly hatched miracidia were used to infect 233 L. columella 5 to 11 mm long. Only 3% of the infected snails survived until the cercariae fully developed. From 190 to 1150 metacercariae developed within 46 to 54 days. Laboratory-bred mice, rats, Guinea pigs, and rabbits were fed metacercariae of different ages, but only the rabbits eliminated eggs in their feces, and this 78 days after infection, Adult worms were recovered after death of the rabbits.

Uniterms: Laboratory infection. Fasciola hepatica. Lymnala columella.


 

 

INTRODUÇÃO

O papel desempenhado pelos moluscos do gênero Lymnaea (Gastropoda, Lymnaeidae) na propagação da fasciolose tem sido discutido por diferentes autores. Vários trabalhos demonstraram a não exclusividade de Lymnaea truncatula como única espécie vetora (Taylor35, 1922; Kendall 14,15, 1949, 1950; Roberts as 1950; Boray 5, 1973; Lang18, 1977). Outros verificaram experimentalmente (Krull16, 1933; Briceño-Rossi6, 1950; Mazzotti23, 1955; Boray4, 1967) ou pelo achado de infecções naturais (Bacigalupo2,3, 1932; Olsen27, 1944) a maior ou menor suscetibilidade das diferentes espécies e linhagens de Lymnaea à Fasciola hepatica. Foram observados ainda que determinadas espécies de limneas, apesar de serem facilmente infectadas, não sobreviviam suficientemente para permitirem o desenvolvimento de cercárias (Hoffmann11, 1930). Verificou-se também que algumas raças geográficas de limneideos, embora suscetíveis, não eram hospedeiras intermediárias competentes, o que limitava a distribuição da doença (Boray5, 1973).

A eficiência de Lymnaea columella como hospedeira intermediária de F. hepatica foi comprovada experimentalmente por vários autores (Krull17, 1933; León-Dancel20, 1970; Rezende e col.80, 1973; Gomes e col.9, 1974; Gonzales e col.10, 1974). Ao lado de infecções experimentais, há referências à infecção natural de L. columella por F. hepatica (Lutz21, 1921; Rezende e col.30, 1973; Gonzales e col.10, 1974).

Neste trabalho são estudados os períodos de desenvolvimento do ovo de F. hepatica até a eclosão do miracídio; de desenvolvimento da larva no caramujo; e o tempo necessário para a eliminação de ovos pelas fezes de alguns vertebrados, após contaminação.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Para a infecção experimental foram utilizados exemplares jovens de L. columella criados em laboratorio, em água não clorada e alimentados com alface fresca. Foram utilizados caramujos medindo entre 5,0 e 11,0 mm.

Os ovos de F. hepatica foram colhidos em bilis de bois infectados naturalmente na região do vale do rio Paraíba do Sul (SP) e de bilis e fezes de coelhos infectados experimentalmente. Estes ovos foram lavados em água e guardados em geladeira até o início das observações.

Para estudo do desenvolvimento dos miracídios, os ovos foram colocados em urna placa de Petri de aproximadamente 9,0 cm de diâmetro contendo cerca de 40 ml de água de torneira, sem cloro, e mantidos a temperatura ambiente. Durante o período de observação foram anotados os valores médios da temperatura ambiente. Diariamente, de manhã e à tarde, as placas eram examinadas à lupa estereoscópica para verificação da eclosão.

As infecções das limneas foram feitas individualmente com 2 a 5 miracídios recém eclodidos. Os pequenos frascos com miracídios e limnea foram colocados sob uma lâmpada de 40 w a 40,0 cm de distância, por um período variável de 3 ou 4 horas. Após esse período de exposição à luz, os caramujos foram colocados em beakers ou pequenos cristalizadores.

Para a obtenção das metacercárias, os caramujos foram colocados em uma placa de Petri contendo água e pequenos fragmentos de gramínea. Vinte e duas horas após o encistamento oferecemos metacercárias aos vertebrados utilizados no experimento. Outras metacercárias foram guardadas em geladeira, para serem posteriormente retiradas algumas horas antes de serem usadas.

Como hospedeiros vertebrados foram utilizados camundongos, ratos, cobaias e coelhos. Trinta e sete camundongos com pesos acima de 12g foram infectados com uma metacercária, excetuando-se 5 camundongos que receberam 2 metacercárias cada um. As metacercárias foram cuidadosamente descoladas do fundo da placa de Petri e com auxílio de uma pipeta depositadas na cavidade bucal do roedor. As idades das metacercárias variaram de 20 horas a 79 dias.

Neste mesmo período e utilizando-se a mesma técnica foram infectados 21 ratos albinos com 3 ou 5 metacercárias com mais de 22 horas. Decorridos cerca de 4 meses da primeira infecção, 10 ratos foram reinfectados com 5 metacercárias de aproximadamente 110 dias.

Dois coelhos, pesando entre 2,0 a 2,5 Kg, foram infectados com 5 metacercárias de 4 dias de idade, presas a gramíneas. Como os resultados fossem negativos, após decorridos aproximadamente 6 meses da primeira infecção, reinfectamos os dois coelhos com 10 metacercárias cada um, também de 4 dias de idade. Desta vez foram utilizadas metacercárias obtidas de infecção natural de limnea coletada em Piquete (SP).

Oito cobaias foram infectadas com 3 a 5 metacercárias de 70 a 100 dias de idade por intermédio da ingestão de gramíneas contaminadas.

Decorridos 1 a 3 meses do início da ingestão de metacercárias, foram iniciados exames de fezes dos animais infectados para pesquisa de ovos de F. hepatica.

 

RESULTADOS

Na Tabela 1 estão registrados os valores da temperatura ambiente. Estão também assinalados a procedência dos ovos, o período de observação e o número de dias necessários para o início de eclosão dos miracídios.

Os miracídios provenientes de ovos colhidos em bilis de bovinos do Vale do Paraíba, com exceção de um lote, começaram a eclodir, na maioria das vezes, a partir do 9o dia, com eclosão de maior número de miracídios entre o 10o e 13o dias. Um lote apresentou maior eclosão no 17o dia. A única exceção foi constatada durante as observações iniciadas em maio de 1978, quando os miracídios começaram a eclodir após 19 dias, atingindo o ápice da eclosão somente no 31o dia. A temperatura ambiente média durante este período foi semelhante a da observação de maio de 1977, ocasião em que os ovos iniciaram a eclosão em 10 dias, com o máximo atingido nos 10o e 12o dias.

Nas quatro tentativas de obtenção de miracídios de F. hepatica a partir dos ovos recolhidos de fezes de dois coelhos, duas resultaram infrutíferas e em outras duas os miracídios somente iniciaram a eclosão a partir do 16o dia, apesar da temperatura ambiente média não ter sido muito diferente daquela registrada durante o desenvolvimento dos ovos de bilis de bovinos. Neste caso, aparentemente a idade dos ovos pareceu não ter tido influência na eclosão dos miracídios, pois foram postos a desenvolver ovos com 2 a 4 dias após eliminação nas fezes e outros com cerca de 2 meses e meio. Estes últimos originaram miracídios na mesma época e na mesma proporção dos ovos de 2 dias. As duas tentativas, mal sucedidas, de eclosão de miracídios foram realizadas com ovos encontrados nas fezes de um mesmo coelho, colhidos em épocas diferentes de infecção, havendo quase um mês de intervalo entre as duas coletas de fezes.

Da vesícula biliar dos coelhos foram recolhidos ovos que eclodiram ao redor do 15o dia, mas em um lote a eclosão iniciou somente no 28o dia. Os ovos permaneceram viáveis, pelo menos, por 40 dias depois de retirados da vesícula biliar e conservados em geladeira. Os ovos postos para observação após 6 a 8 meses da coleta não eliminaram miracídios, embora os coletados há 6 meses tivessem iniciado a divisão celular. O mesmo não aconteceu com os ovos recolhidos da vesícula biliar há 8 meses, que não mostraram sinais de divisão celular.

Os miracídios de F. hepatica nadaram ativamente na água, à temperatura ambiente, por um período de 6 a 7 horas aproximadamente. Após 9 horas a maior parte dos miracídios estava morta e decorridas 11 horas da eclosão somente alguns continuavam em movimento.

Com os miracídios eclodidos de ovos provenientes de bilis de bovinos do Vale do Paraíba, foram infectados 233 L. columella em diferentes ocasiões. Desse total de caramujos infectados a maior percentagem de mortos (23%) ocorreu nos primeiros 10 dias do início da infecção. O número de caramujos mortos continuou relativamente grande até o 30o dia de infecção (percentagem variando entre 19% e 17%), diminuiu muito entre o 30o e 40o dias (8%), tornando a aumentar entre o 40o e 50o dias (16%). Este último período correspondeu à época da presença de rédias e cercarias na região do hepatopâncreas do caramujo. A grande maioria das limneas infectadas não sobreviveu tempo suficiente até a eliminação de cercáiras, sendo que somente 6 exemplares (3%) forneceram cercarías. A percentagem de limneas mortas em diferentes idades de infecção, antes de se completar o desenvolvimento do parasita, foi de 84%. Alguns caramujos expostos aos miracídios de F. hepatica (11%) não apresentaram evidências de infecção após 30 ou 40 dias. Se não se considerar as exposições de limneas a miracídios realizadas de maio a julho de 1978, quando a quase totalidade das limneas não se infectou, a percentagem de caramujos infectados foi de 99%. O insucesso da tentativa de infecção de limneas, levada a efeito entre maio e julho de 1978, poderia ser atribuída a vários fatores, inclusive, talvez, a um fenômeno relacionado com o pequeno poder de penetração dos miracídios oriundos de ovos já colhidos e separados há muito tempo ou devida a suscetibilidades individuais de caramujos e miracídios.

Em decorrência do pequeno número de miracídios obtidos de fezes de coelhos, a infecção foi feita sempre com reduzido número de larvas por molusco. Desse modo foram infectados, com miracídios desta proveniência, somente 4 limneideos, sendo que um morreu antes de atingir o 30o dia e os outros três não mostraram sinais de infecção mesmo após 35 dias.

Dos ovos colhidos em bilis de coelhos eclodiram vários miracídios, que foram usados para infectar 30 limneas. Dessas limneas, todas que se infectaram morreram antes de dar origem a cercarías, e urna boa parcela, cerca de 33%, não mostrou sinal de infecção, mesmo após 20 dias da exposição.

As cercarías, após saírem das rédias, permaneceram por vários dias na região do hepatopâncreas.

Apesar de constantes exposições à luz depois do 40° dia de infecção, por um período de 2 horas, os caramujos não eliminaram cercárias. As cercárias, em nosso laboratório, não chegaram a ser eliminadas espontaneamente, mas somente conseguiram sair quando os caramujos foram retirados da concha.

A maior parte das cercárias, obtidas entre 46° a 54° dias de infecção, encistou em menos de 15 minutos no fundo da placa de Petri. Poucos encistaram no ramo de capim colocado na placa.

As metacercárias, logo que se formaram eram brancas e depois tornaram-se gradativamente mais amarelas até adquirirem a cor amarela-alaranjada, ocasião em que a capa protetora da metacercária já estava bem consistente.

O número de metacercárias formadas foi de cerca de 200 em um caramujo infectado com 2 miracídios; de aproximadamente 190, em um exposto a 3 miracídios, e cerca de 1150, em outro exposto a 5 miracídios.

As metacercárias somente começaram a ser usadas para infecção dos roedores e coelhos após cerca de 22 horas do encistamento. Verificou-se, em nosso laboratório, que a viabilidade das metacercárias guardadas em geladeira foi de cerca de 4 meses.

A Tabela 2 registra o número de animais usados para infecção, bem como o número de metacercárias ingeridas.

As fezes dos camundongos que ingeriram metacercárias, começaram a ser examinadas entre o 34o e 38o dias, apresentando-se sempre negativas. Alguns camundongos eliminaram ovos muito semelhantes aos de F. hepatica, mas sem embrião, entre o 70o e 73o dias.

Entre o 28o e 35o dias morreram 3 camundongos, e os restantes foram sacrificados posteriormente. Examinando-se as vísceras desses camundongos não foram constatados quaisquer sinais de infecção.

Os primeiros ratos foram sacrificados após quase 4 meses, com resultados negativos no fígado e nas fezes.

A partir de aproximadamente 3 meses foram feitos exames nas fezes dos demais ratos, cobaias e coelhos, sendo todos negativos para ovos de F. hepatica.

Cerca de 5 meses e meio após a ingestão das metacercárias, todos os animais, exceto os coelhos, estavam mortos ou sacrificados. Em nenhum destes animais foram encontrados ovos nas fezes, ou fascíolas no fígado.

Os coelhos que foram reinfectados com metacercárias oriundas de molusco naturalmente infectado estavam eliminando ovos nas fezes após 78 dias. Um dos coelhos morreu com pouco menos de 3 meses de reinfecção, sendo recuperados 6 vermes no fígado. Estes vermes eram grandes, medindo em média 23,4 por 7,9 mm, com a glândula vitelínica de cor clara. O outro coelho morreu cerca de 5 meses e meio após a reinfecção, obtendo-se somente 2 vermes bem desenvolvidos, com um deles eliminando ovos, espontaneamente, em solução fisiológica. Estes vermes eram maiores que os obtidos no primeiro coelho, medindo em média 24,7 por 10,0 mm, com coloração escura da glândula vitelínica.

Do total de 68 animais que ingeriram metacercárias, somente dois coelhos mostraram-se positivos na reinfecção.

 

DISCUSSÃO

O início de eclosão de miracídio de F. hepatica em nossa experiência, ocorreu entre 9o e 16o dias, com temperatura ambiente de 23,8° a 26,6°C, coincidindo com as observações de vários autores (Roberts32, 1950; Briceño-Rossi 6, 1950; Rey 31, 1957; León-Dancel 20, 1970; Standen citado por Schnitzer e Hawking33, 1963; Gomes e col.9, 1974; Gonzales e col.10, 1974; Nice e Wilson24, 1974; Whitlock e col.36, 1976). Nossos ovos não foram incubados em estufa a uma temperatura constante, nem foram colocados no escuro.

Para temperaturas médias que variaram de 26,3° a 23,5°C o início da eclosão dos miracidios, em um lote, registrou-se a partir do 28o dia para ovos colhidos em bilis de coelho, e o ápice de eclosão de miracídios em um lote de ovos provenientes de bilis de boi foi verificada no 31o dia. No entanto, a literatura cita valores semelhantes apenas para temperaturas mais baixas como 17°C (Roberts32, 1950) e 11° e 18°C (Rey 31, 1957).

Briceño-Rossi6 (1950) verificou que, nas mesmas condições, foi variável o número de dias requeridos para o início da eclosão dos miracídios de F. hepatica provenientes de fígado de boi e de fezes de pacientes. Referiu ainda que houve diferença de viabilidade de ovos de F. hepatica com relação a sua origem. Os ovos de F. hepatica colhidos em fezes humanas, segundo este autor, quando colocados nas mesmas condições que os de origem bovina, não fertilizam, ou o fazem em escassa quantidade.

Jimenez-Albarran e Guevara-Pozo12 (1977), comparando o número e a viabilidade dos ovos de F. hepatica encontrados em vesícula biliar de vacas, ovelhas e cabras, chegaram a conclusão de que, tomando-se como grau de parasitismo o número de ovos que aparecem na bilis, as vacas foram as mais parasitadas e maior número de seus ovos mostraram capacidade de desenvolver miracídio. Mas, o índice de viabilidade (quociente entre número de ovos com miracídio liberado e o número total de ovos) dos ovos de bilis de ovelhas foi maior que os de bilis de vaca e cabras.

Os miracídios obtidos na nossa experiência permaneceram em movimento ativo por um período muito maior que o relatado por León-Dancel 20 (1970), Gomes e col.9 (1974) e Christensen e col.7 (1976), mas ligeiramente inferior ao citado por Rey 31 (1957). Pantelouris 28 (1965) citou, em seu livro, que alguns autores registraram sobrevivência de miracídios por 5,30 horas a 27°C e 6 a 8 horas a 30°C, ou até mesmo sobrevivência por 40 horas, apesar da atividade diminuir com o tempo. A esse respeito Pantelouris28 (1965) observou que essas discrepâncias poderiam ser devidas a diferenças locais de cepas de F. hepatica ou devidas a diferenças de oxigenação, pH ou salinidade da água.

O problema da idade e do tamanho das limneas na época da infecção pelos miracídios é uma questão que tem sido discutida por vários autores.

Roberts32 (1950) utilizou nas suas experiências sobre infecção experimental de F. hepatica exemplares de L. truncatula medindo 2,5 mm de comprimento, apesar de ter encontrado caramujos de todos os tamanhos naturalmente infectados. Segundo este autor foram escolhidos caramujos de 2,5 mm de comprimento para contrabalançar a alta mortalidade entre caramujos menores de 2,5 mm e a aparente relutância do miracídio em penetrar tecidos de caramujos maiores que 6,0 mm. Mas, Christensen e col.7 (1976) aparentemente não encontraram dificuldades ao empregarem em seus estudos exemplares de L. truncatula medindo 4,0 a 6,0 mm de comprimento. Embora Jimenez-Albarran e Guevara-Pozo13 (1977) não tenham se referido ao tamanho de L. (Galbo) truncatula estudaram a influência da idade das limneas na infecção pela F. hepatica. Nesta pesquisa os autores constataram a dificuldade de infectar limneas muito pequenas com 1 ou 2 semanas de idade, pois estas ou não se infectavam ou morriam antes da liberação das cercárias. Desse modo aconselharam a utilização de limneas de idade maior que 1 ou 2 semanas, de preferência a partir da quarta semana de vida.

Kendall 15 (1950) observou que miracídios de F. hepatica atacavam exemplares de L. stagnalis de todos os tamanhos, mas a infecção não persistia em caramujos maiores e mais velhos, havendo desenvolvimento de rédias apenas nos menores indivíduos de cada grupo.

Quanto a L. columella, preferimos adotar aproximadamente o tamanho utilizado por León-Dancel20 (1970) e Gomes e col.9 (1974), que já haviam sido bem sucedidos empregando limneas de 8,0-10,0 mm e 7,0-9,0 mm (com 24 a 35 dias de idade) de comprimento, respectivamente.

Ainda a respeito do tamanho da limnea infectada, Ollerenshaw25 (1971) afirmou que, na natureza, a determinação do nível de infecção é de pouco valor do ponto de vista da epidemiologia da fasciolose. Um fator importante é o tamanho da população, se bem que uma população grande de caramujos não seja necessariamente condição prévia de alta incidência de doença. Outro fator importante é o tamanho do caramujo infectado, que quando maior e bem alimentado, produz mais cercárias, podendo aumentar consideravelmente o número de rédias que se desenvolvem em exemplares maiores. O que importa, efetivamente, na disseminação da fasciolose em uma dada região é, segundo Ollerenshaw25 (1971), o número absoluto e o tamanho dos caramujos infectados.

O número de parasitas presentes, representado pelo número de esporocistos e rédias, bem como o tempo necessário para o desenvolvimento da larva até a emergência de cercárias, variam com as espécies de Lymnaea e com as condições externas. Kendall15 (1950) notou que é raro encontrar mais de um esporocisto em L. palustris jovem, enquanto L. truncatula da mesma idade e infectada nas mesmas condições, desenvolveu 30 esporocistos. Em dissecções feitas mais tarde em exemplares de L. pa lustris e L. glabra foram observadas 30 rédias bem desenvolvidas, enquanto que L. truncatula nas mesmas condições apresentou 150-300 rédias. O desenvolvimento de cercarías completando-se entre 28o a 35o dias foi assinalado em exemplares de L. tomentosa (Boray4, 1967; Whitlock e col.30, 1976) à temperatura de 22° a 24°C. Em L. cabensis, as cercárias desenvolveram em tempo menor, de 26° a 27° dias (Briceño-Rossi6, 1950), embora Rezende e col.30 (1973) tenham referido somente 20 dias para a formação de cercárias. Rey31 (1957) citou um período de 35 a 98 dias para a evolução dos esporocistos até cercárias, sem no entanto fazer referências à emergência de cercárias neste período.

Krull17 (1933) relatou em L. columella a presença de rédias, contendo rédias filhas, um mês após infecção e León-Dancel20 (1970) também assinalou a presença de rédias decorrido um mês da infecção, mas não fez referências a rédias filhas. Rezende e col.30 (1973) constataram a formação de rédias mães em L. columella com somente 9 dias de infecção e de rédias filhas aos 20 dias, constatando presença de cercárias entre 30o a 33o dias. Gonzales e col.10 (1974) registraram o encontro de formas de rédias 42 dias após a infecção. Na nossa experiência, não observamos formação de rédias filhas.

Em relação a presença de rédias de 1o e 2o gerações na infecção experimental de F. hepatica, Maldonado22 (1965) relatou que não há uma regra para a formação de rédias filhas e observou a presença de rédias filhas e cercarías em uma mesma rédia mãe. Wright37 (1971) afirmou que na Grã-Bretanha, em condições naturais, as rédias filhas são produzidas freqüentemente, mas L. truncatula infectada, mantida em laboratório, não mostrou evidência de produção de segunda geração de rédias. Estudando a formação de rédias filhas, Wright37 (1971) chegou a conclusão, por meio de experiências, que o desenvolvimento da 2a geração de rédias em F. hepatica é inibida em temperaturas anormalmente altas.

Taylor34 (1965), assinalando o aparecimento de rédias filhas em certas condições desfavoráveis, sugeriu influência das variações sazonais para a formação de 2a geração de rédias. Afirmou, no entanto, que não se conhecem exatamente as razões que levam ao aparecimento destas rédias. Relatou ainda a produção mais freqüente de rédias de 2a geração no final do verão.

Roberts32 (1950) citando o trabalho de Ross e McKay (1929), relatou a produção de um grande número de rédias filhas durante o verão. Sugeriu que o principal efeito de temperaturas altas é permitir a regeneração da glândula digestiva, de modo a favorecer a disponibilidade de alimento para o parasita e conseqüentemente produção maior de cercárias.

Bacigalupo 1 (1938) assinalou, uma única vez em L. viatrix a presença de rédias filhas durante o inverno. Segundo este autor esta seria uma das diferenças entre L. viatrix e as outras espécies de Lymnaea que servem de hospedeiros intermediários a F. hepatica, pois nestas últimas foi demonstrado o desenvolvimento de rédias filhas no verão, e de cercárias no inverno.

A emergência de cercárias foi observada a partir do 30o dia (Rezende e col.30, 1973) para L. cubensis. Entretanto, vários autores observaram em outras espécies, emergência entre 32o a 42o dias à temperatura de 25°C (Krull 16, 1933; Roberts 32, 1950; Taylor34, 1965; Standen citado por Schnitzer e Hawking 33, 1963; Jimenez-Albarran e Guevara-Pozo13 (1977). Bacigalupo1 (1938) citou emergência espontânea entre 57o a 80o dias para L. viatrix. Kendall 14,15 (1949, 1950) também registrou tempo mais longo para emergência, de 3 a 4 meses, para 3 espécies de Lymnaea.

A emergência de cercárias verificada por nós, entre o 46o a 54o dias, está de acordo com o obtido por outros autores que trabalharam com L. columella (Krull17, 1933; Rezende e col.30, 1973; Gomes e col.9, 1974). León-Dancel20 (1970), no entanto, constatou a eliminação de cercárias 57 a 60 dias após infecção, mostrando, portanto, uma evolução ligeiramente mais lenta que a observada por nós. Na nossa experiência, as cercárias não emergiram espontaneamente, o que confirmou a observação de Lutz 21 (1921) que viu que as cercárias se acumulavam no ápice da concha, esperando a morte do hospedeiro e logo que o corpo se desprendia da casca ou quando se quebrava o ápice, as cercárias saíam e encistavam em objetos sólidos.

As nossas cercárias não foram liberadas imediatamente após terem saído das rédias, o que confirmou a observação de Maídonado 22 (1965) que mencionou o transcurso de um tempo considerável entre o nascimento da cercaria e o momento dela estar pronta para deixar o caramujo. Segundo Maldonado22 (1965), aparentemente, durante este tempo ocorre algum processo de maturação fisiológica, uma vez que não há diferença estrutural entre uma e outra forma.

Na nossa experiência, em infecções com 2 a 5 miracídios, a percentagem de caramujos mortos antes da eliminação de cercárias foi muito alta, obtendo-se pouquíssimos exemplares que se mantiveram infectados e sobreviveram tempo suficiente até as cercárias completarem seu desenvolvimento. Além disso, a percentagem de limneas que não se infectou foi relativamente alta, principalmente se levarmos em consideração o fato de que não houve infecção positiva em todo um lote. Porém, a nossa taxa de não infecção foi menor que a encontrada por Krull17 (1933) que foi de 17,3% também para L. columello.

Trabalhando com L. columella León-Dancel20 (1970) observou que quando os caramujos eram expostos a um número reduzido de miracídios variando de 2 a 4 e 4 a 6, a percentagem de mortos foi de 20,0% e 41,0%, respectivamente, enquanto que os expostos a um número de 6 a 10 miracídios morriam antes da eliminação de cercárias. As infecções em massa realizadas com 10 a 16 miracídios por caramujo, também resultaram mortais para os caramujos, não chegando a produzir cercárias. No entanto, Gomes e col.9 (1974), trabalhando com L. columella em condições semelhantes as de León-Dancel20 (1970), obtiveram um índice de mortalidade mais baixo, de 15,0% para caramujos expostos a 2-5 miracídios. E para caramujos expostos a um número variável de 5 a 8 miracídios, o índice de mortalidade foi de 31,0%. Para os infectados em massa, empregando-se em média 12 a 16 miracídios por hospedeiro, não foi observada sobrevivência dos caramujos por tempo suficiente para eliminação de cercárias, o que concorda com o relatado por León-Dancel20 (1970). Se compararmos os resultados obtidos por estes dois autores, as nossas percentagens de caramujos mortos foi extremamente alta (84,15%), apesar de termos utilizado pequeno número de miracídios.

Alta percentagem de morte entre os caramujos infectados, antes da eliminação de cercárias foi assinalada por Krull16 (1933) que observou 62,5% de morte e por Hoffman11 (1930) quando notou que os exemplares de L. cubensis apesar de facilmente infectados, não sobreviviam tempo suficientemente longo para permitir desenvolvimento de cercárias. A não eliminação de cercárias pelas limneas infectadas foi relatada por Krull10 (1933) em uma infecção experimental em Fossaria modicella. Esta não eliminação de cercárias foi explicada pelo autor como devida à completa destruição do hepatopâncreas muito antes da maturação de qualquer cercaria em virtude de uma quantidade muito grande de parasitas.

É interessante observar que apesar da percentagem alta de morte dos caramujos infectados na experiência realizada por Krull16 (1933) a percentagem de não infecção foi bastante baixa, de apenas 5%.

Na fase final da nossa experiência, os poucos caramujos sobreviventes já estavam moribundos, de modo que os animais foram retirados das conchas e as cercárias que já estavam fora das rédias há bastante tempo foram libertadas e logo depois encistaram.

A quantidade de cercárias obtidas a partir de infecção por grande número de miracídios de F. hepatica variou desde 44 cercárias por dia, com média diária de 5 cercárias por caramujo (Krull 16, 1933) a 156 cercárias em 24 horas (Kendall 14,15 1949, 1950). Em infecções com 5 a 10 miracídios foram obtidos de 476 a 544 cercárias que emergiram de cada caramujo (Roberts32, 1950) e uma média de 142,55 a 312,46 cercárias por caramujo em 24 horas (Jimenez-Albarran e Guevara-Pozo 13 1977).

Segundo Krull 16 (1933) a emergência de cercárias foi errática e algumas vezes decorriam muitos dias sem que houvesse liberação de nenhuma cercaria. A experiência de Jimenez-Albarran e Guevara-Pozo 13 (1977) comprovou o início de emergência de cercárias a partir da 6a semana após infecção, havendo maior liberação na 8a semana.

A respeito do número de cercárias produzidas por L. columella, Krull17 (1933) infectando em massa, observou que o maior número de cercárias eliminadas por um caramujo em um único dia foi 161. Em uma limnea que expeliu cercárias por dois dias, quando examinada mostrou no hepatopâncreas 241 rédias e 356 cercárias maduras.

Em 1970, Léon-Dancel 20 verificou que L. columella infectadas com 2 a 4 miracídios produziram em média 312 metacercárias e os infectados com 4 a 6 miracídios uma média de 298 metacercárias. Observou ainda que todos os caramujos morreram 2 a 6 dias depois de terem eliminado as cercárias. Gomes e col.9 (1974) conseguiram obter uma média de 335 metacercárias em exemplares infectados com 2 a 5 miracídios e média de 303 metacercárias com 5 a 8 miracídios. Todos os infectados morreram 3 a 7 dias após a emergência das cercárias.

Nossos dados mostraram-se inferiores ao dos dois autores acima citados para infecções com 2 e 3 miracídios, mas muito superiores para infecção com 5 miracídios, até mesmo superiores ao número obtido por Roberts32 (1950) em L. truncatula com 5 miracídios. Isto provavelmente porque nossos números referem-se a dados individuais e não à média. Não pudemos comparar nossos resultados com os de Krull17 (1933) porque nas infecções em massa nossos caramujos morreram antes de permitir o desenvolvimento de rédias e como não obtivemos liberação espontânea de cercárias não houve possibilidade de verificarmos o número de cercárias libertadas em um dia.

Sob o ponto de vista da duração da infecção em diferentes espécies de Lymnaea, Kendall 15 (1950) assinalou na Inglaterra a persistência da infecção em L. truncatula durante toda a vida, até a morte do caramujo. No entanto, L. stagnalis conseguiu livrar-se da infecção após a liberação de certo número de cercárias. Observações posteriores nesta mesma espécie sugeriram que a infecção foi mantida durante 3 meses aproximadamente, quando umas poucas rédias não desenvolvidas puderam ser encontradas em caramujos que anteriormente continham grande número de cercárias maduras.

A morte de exemplares de L. truncatula infectada foi assinalada também por Roberts32 (1950) que verificou que a emergência de cercárias se processava durante um período de 2 a 8 dias, com morte sobrevindo 8 dias após o início da eliminação das larvas. Observou ainda que L. truncatula infectada morria invariavelmente, em laboratório e em campo, depois de ter eliminado um certo número de cercárias. Jimenez-Albarran e Guevara-Pozo13 (1977) relataram um período maior de eliminação de cercárias e também sobrevivência mais longa, pois observaram o início da eliminação de cercárias na 6a semana, atingindo maior número de emergências na 8a semana. A morte de L. truncatula ocorreu a partir da 12a semana de infecção. A literatura disponível registra que morte de L. columella ocorre pouco tempo depois da eliminação de cercárias, mas não faz referências quanto a cura espontânea da infecção.

Em nosso experimento as cercárias encistaram-se em menos de 15 min., o que corrobora a opinião de Hoffman11 (1930) de que as cercárias de F. hepatica encistam quase imediatamente nos recipientes que contêm os caramujos. O encistamento das cercárias ocorrendo entre 15 a 20 min. raramente ultrapassando 30 min. foi assinalado por Bacigalupo 1,3 (1932, 1938); León-Dancel20 (1970); Gomes e col.9 (1974). Um período mais longo para encistamento foi citado por Rey31 (1957) que assinalou formação de metacercárias em poucas horas e por Taylor34 (1965) que referiu um período de 15 min. a uma hora.

O encistamento se dá em objetos e raramente na água (Bacigalupo1, 1938), mas Krull16 (1933) relatou o encontro de metacercárias também na superfície da água e Roberts32 (1950) assinalou que 60% das cercarías de F. hepatica obtidas de L. truncatula encistaram no menisco da água, 25% flutuaram na superfície da água e 15% no fundo do recipiente.

Hoffman11 (1930) e Mazzotti 23 (1955) utilizaram metacercárias para ingestão por cobaias, aproximadamente 24 horas após o encistamento obtendo resultados positivos. Taylor34 (1965) afirmou que as metacercárias se tornavam infectantes em 2 ou 3 dias. Esta pode ter sido uma das causas do insucesso da nossa primeira série de infecções, quando usamos metacercárias com pouco menos de 24 h do encistamento e somente obtivemos êxito quando empregamos metacercárias com 4 dias de idade. Standen citado por Schnitzer e Hawking 33, 1963) armazenou metacercárias em geladeira por uma semana antes de usá-las para infectar animais e usava somente as viáveis, isto é, aquelas que exibiam glândulas cistogênicas pareadas. No entanto, Standen observou que as metacercárias podem permanecer vivas por muitos meses (comprovação feita através de uma infecção bem sucedida em camundongos, após 18 meses de armazenamento), mas a proporção de metacercárias viáveis começa a decrescer após 3 ou 4 meses. Rajasekariah e Howell29 (1977) também usaram metacercárias armazenadas a 4°C após confirmarem a viabilidade através dos granulos excretores refráteis.

Ollerenshaw25 (1971) relatou a sobrevivência, por uns meses, das metacercárias durante o inverno, no campo, de modo que quase toda a vegetação infectada, provavelmente é consumida, no outono ou no inverno, concorrendo assim para a manutenção dos focos de fasciolose. Rey31 (1957) salientou que as metacercárias resistem por algumas semanas nas ferragens secas e até um ano nas ferragens úmidas, permanecendo vivas na água até 80 dias à temperatura de 22° e 31 °C.

Alguns vertebrados de pequeno porte foram utilizados por vários autores para infecção experimental de F. hepatica, como o camundongo (León-Dancel20, 1970; Standen citado por Schnitzer e Hawking 33, 1963; Gomes e col.9, 1974), ratos (León -Dancei20, 1970; Rajasekariah e Howell29, 1977) e cobaias (Lutz 21, 1921; Hoffman11, 1930; Bacigalupo2,3, 1932; Mazzotti23, 1955). Infecções em coelhos foram assinaladas por Krull16 (1933), e Dacal 8 (1979).

Com relação a infecção experimental de F. hepatica em cobaias, Lutz21 (1921) demonstrou que metacercárias maduras, quando ingeridas úmidas, davam origem a distômulos e que após alguns dias as cobaias morriam com peritonite sero-hemorrágica, podendo-se encontrar os distômulos no fígado e na cavidade peritonial. Hoffman 11 (1930) infectou 5 cobaias com 25 a 130 metacercárias e após um período de 23 a 33 dias de infecção obteve, com a morte das cobaias, adultos jovens de F. hepatica havendo grande degeneração do fígado. Bacigalupo2,3 (1932) em duas experiências distintas infectando 4 cobaias de cada vez com um número variável de metacercárias, obteve pequenos parasitas no peritônio ou no fígado. Observou com a morte das cobaias, ocorrida após 27 a 45 dias, lesões hepaticas intensas. Mazzotti23 (1955), também assinalou morte de uma cobaia aos 45 dias com ampla zona de fibrose no fígado, recuperando 2 fasciolas jovens.

León-Dancel 20 (1970) conseguiu que camundongos infectados sobrevivessem com 1 metacercária, observando ovos nas fezes pela primeira vez após 31 dias de infecção. Usando apenas 1 metacercária este autor conseguiu 60% de infecção positiva em camundongos. Standen citado por Schnitzer e Hawking33, 1963) infectou camundongos com 10 metacercárias, obtendo 4 fasciolas jovens por camundongo. Estes camundongos morreram com 42 dias, antes das fasciolas atingirem sua maturidade sexual, mas com danos no fígado. Standen citou ainda Lagrange e Gutmann (1961) que observaram morte de camundongos infectados com pequeno número de metacercárias depois de 4 ou 5 semanas, notando presença de pequenas fasciolas imaturas no fígado e na cavidade peritonial. Standen citado por Schnitzer e Hawking33, 1963) afirmou ainda que infecções com uma única metacercária podem ser bem sucedidas, sendo que se o camundongo sobreviver além de 33 dias, poderão ser encontrados fasciolas maduras no fígado que eliminarão centenas de ovos nas fezes por um período ilimitado. Este mesmo período de 33 dias para maturação das fasciolas foi constatado por Gomes e col.9 (1974) que, ao infectarem camundongos com 2 metacercárias, assinalaram o aparecimento dos primeiros ovos nas fezes após 33 dias. No entanto esses autores não tiveram sucesso em infecções de camundongos que ingeriram mais de 3 metacercárias, pois todos os roedores morreram antes do aparecimento de ovos nas fezes.

Em relação a infecção experimental em ratos, León-Dancel20 (1970) notou que os animais infectados sobreviviam quando ingeriam até 5 metacercárias, aparecendo ovos nas fezes pela primeira vez 51 dias após infecção. Em autópsias realizadas, esse autor constatou fasciolas em 85% dos ratos que receberam um a 4 metacercárias. Os vermes recuperados mediam 11 a 13 mm de comprimento por 4 a 5 mm de largura.

Rajasekariah e Howell29 (1977) estudando a influência da idade do hospedeiro vertebrado e do número de metacercárias utilizadas na infecção, verificaram que os ratos com 5 semanas de idade eram mais suscetíveis à infecção. Estes animais apresentaram lesões inflamatórias em todos os lóbulos hepáticos quando infectadas por 5 metacercárias sendo que, nessa faixa etária, a recuperação do número de vermes foi maior. Em ratos infectados com 15 e 25 semanas de idade, estas mesmas lesões apareciam somente quando ingeriam 15 a 20 metacercárias. Observaram ainda que o período prepatente variou de 57 a 60 dias em todos os grupos e que a infecção estava restrita ao conduto biliar, não encontrando vermes migratórios no parênquima hepático. Concluiram que, dentro de cada grupo etário de ratos, a proporção de metacercárias que se desenvolviam até a maturidade era a mesma independentemente do número de metacercárias e que estes resultados indicavam não ocorrer efeito "crowding". Os autores sugeriram que roedores após completar 10 semanas desenvolviam resistência à infecção. Não notaram ainda diferença entre os vários grupos etários quando administravam apenas uma metacercária.

Krull 16 (1933) infectou um tapiti (Sylvilagus floridanus maüurus) capturado ainda bem jovem, com 37 metacercárias ingeridas durante um período de 9 dias. Após 20 dias da ingestão inicial de metacercárias, o tapiti foi morto, obtendo-se 25 fasciolas imaturas (67,6%). Após fixação verificou-se que as fasciolas mediram 1,5 a 4,5 mm de comprimento, com média de 3,0 mm. Outro tapiti da mesma ninhada infectado com 12 metacercárias mostrou ovos nas fezes após 101 dias de infecção. Quando as fezes foram examinadas 60 dias após, não foram encontrados ovos. Com a morte do tapiti ocorrida no 102o dia foram recolhidos 3 F. hepatica adultos (25,0%), medindo cerca de 20,0 mm de comprimento

Comparando os nossos resultados com os de Krull16 (1933) obtivemos ovos nas fezes de coelhos (Oryctolagus cuniculus) 23 dias antes daquele autor, mas cerca de 15 dias depois do assinalado por Olsen 26 (1974). Com a morte dos coelhos recuperamos 60% e 20% dos vermes, o que representou uma percentagem semelhante a encontrada por Krull16 (1933). Em relação a sobrevivência, um dos nossos coelhos infectados morreu cerca de 20 dias antes do de Krull16 (1933) e o outro quase dois meses depois, eliminando sempre ovos nas fezes durante este período. O tamanho médio dos vermes recuperados foi também maior que o observado por Krull.

Quanto a longevidade da F. hepatica em coelhos, Leiper 19 (1938), citou um trabalho de Montgomerie (1931) em que este autor relatava a sobrevivência dos coelhos infectados por um período de 1 a 3 anos após infecção.

Leiper19 (1938) ao infectar 16 cabras de aproximadamente 6 meses de idade com 30 a 100 metacercárias, observou início da eliminação de ovos nas fezes após 78 dias, e nas cabras que não morreram ou não foram sacrificadas, eliminação de ovos persistiu por quase 5 anos. O número de vermes adultos recuperados nas cabras mortas variou de 15,0 a 58,0%, com média de 35,5%.

 

CONCLUSÕES

1) À temperatura ambiente os miracídios de F. hepatica provenientes de ovos de bilis de boi eclodiram entre 9o e 13o dias. Os miracídios de ovos colhidos nas fezes e na bilis de coelhos eclodiram ao redor de 15o dia. Os miracídios nadaram ativamente durante 6 a 7 h.

2) A percentagem de limneas infectadas que sobreviveram até o desenvolvimento completo das cercanas foi de apenas 3%. O índice de infecção de L. columella expostas a miracídios de F. hepatica foi de 89%. Não foi observada a formação de rédias filhas.

3) As cercárias não sairam espontaneamente do caramujo, sendo retiradas das conchas entre 46o a 54o dias após infecção. O encistamento das cercárias processou-se em menos de 15 minutos.

4) Foram obtidas cerca de 200 metacercárias em caramujos infectados com 2 miracídios, aproximadamente 190 com 3 miracídios e 1150 com 5 miracídios. A viabilidade das metacercárias guardadas em geladeira foi de cerca de 4 meses.

5) Os coelhos iniciaram a eliminação de ovos pelas fezes 78 dias após ingestão de 10 metacercárias. Foram recuperados, após a morte dos coelhos, 6 vermes adultos em um dos coelhos e 2 em outro.

 

AGRADECIMENTOS

Aos Drs. Sérgio Vianna e Arnor Fadu Saber, aos demais funcionários da Casa da Lavoura de Pindamonhangaba e Casa da Agricultura de Lorena (SP), pela colaboração na cessão de ovos de F. hepatica e nas coletas de limneideos.

 

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Recebido para publicação em 23/07/1979
Aprovado para publicação em 30/10/1979