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Revista de Saúde Pública

Print version ISSN 0034-8910

Rev. Saúde Pública vol.30 n.3 São Paulo Jun. 1996

http://dx.doi.org/10.1590/S0034-89101996000300009 

Determinação espectrofotométrica e cromatográfica em fase gasosa de ácido tricloracético em urina*
Spectrophotometric and gas chromatographic determination of trichloroacetic acid in urine

Maria de Fatima M. Pedrozo e Maria Elisa P. B. Siqueira

Instituto Médico Legal de São Paulo. São Paulo, SP - Brasil (M.F.M.P.), Escola de Farmácia e Odontologia de Alfenas. Alfenas, MG - Brasil (M.E.P.B.S.)

 

 

RESUMO

Solventes halogenados ¾ 1,1,1-tricloretano, tricloretileno, percloretileno ¾ apresentam o ácido tricloracético (TCA) como produto de biotransformação comum, o qual pode ser utilizado como indicador biológico de dose interna na exposição a estes compostos. Foi realizado estudo de métodos espectrofotométrico e cromatográfico em fase gasosa para a determinação do TCA, bem como da aplicação destes métodos à sua determinação em urina de indivíduos expostos ao 1,1,1-tricloretano. Os resultados mostram a boa precisão à determinação do TCA em urina de indivíduos expostos ao 1,1,1-tricloretano e nenhuma diferença significativa foi observada entre os métodos, ainda que o cromatográfico em fase gasosa apresentasse menor limite de detecção.

Ácido tricloracético, urina. Espectrofotometria, utilização. Cromatografia gasosa, utilização.

ABSTRACT

Some chlorinated hydrocarbon solvents ¾ 1,1,1-trichloroethane, tricloroethylene and perchloroethylene ¾ have a common biotransformation product, trichloroacetic acid, which can be used as their biological exposure index. The spectrophotometric and gas chromatographic methods for the determination of trichloroacetic acid were studied and used as well as in its determination in the urine of workers exposed to 1,1,1-trichloroethane . Both methods showed good precision and no statistically significant difference was found although the gas cromatographic method presented a lower detection limit.

Trichloroacetic acid, utine. Spectrophotometry, utilization. Chromatography, utilization.

 

 

INTRODUÇÃO

Alguns solventes halogenados (1,1,1-tricloretano, tricloretileno, percloretileno), utilizados no desengraxamento de peças metálicas, apresentam o ácido tricloracético (TCA) como produto de biotransformação comum. Entretanto, as concentrações urinárias de TCA diferem de um para outro solvente, dependendo da extensão com que são biotransformados:

- 2 a 4% para o 1,1,1-tricloretano11, 15, 19,21

- 10 a 30% para o tricloretileno4, 9, 19, 29

- 2% para o percloretileno8,13, 26.

A American Conference of Governmental Industrial Hygienists2 (1986) preconiza a determinação de TCA urinário no final da semana de trabalho para monitorizar trabalhadores expostos a esses solventes. No Brasil, a NR-7 propõe a determinação dos triclocompostos totais (TCT) na urina (colhida no final da semana de trabalho) e analisados como TCA através de método espectrofotométrico, na monitorização da exposição ocupacional ao tricloretano18. Ainda que exista grande variação interindividual, esse indicador biológico de dose interna integra a exposição da semana, permitindo a avaliação da exposição ocupacional6, 14, 15, 23, 27, 28, 30, 33, 34. As técnicas mais empregadas na quantificação do TCA são a espectrofotometria do visível10, 12, 17, 24, 25, 32 e cromatografia em fase gasosa (CG) 3, 5, 7, 22, 26, 31, 35, 36.

Os métodos espectrofotométricos baseiam-se na reação de Fujiwara, com formação de uma base de Schiff pela reação do TCA com piridina e alcali e posterior leitura da absorvância em comprimento de onda adequado. Outros compostos halogenados podem ser também determinados por esta reação desde que previamente oxidados a TCA; substâncias cromóforas presentes na urina podem interferir na formação do complexo colorido, o que torna a reação inespecífica.

Os métodos cromatográficos em fase gasosa são mais sensíveis e específicos. O TCA pode ser determinado por CG após extração e metilação7, 22; metilação direta da amostra e volatilização dos compostos de interesse pela técnica de "head space", e CG5, 20 pela indução da descarboxilação do TCA , medindo-se o clorofórmio formado31.

O estudo de método espectrofotométrico e cromatográfico em fase gasosa, assim como a comparação dos resultados obtidos por estas duas técnicas na determinação de TCA em urina de trabalhadores expostos ao 1,1,1- tricloretano constituíram o objetivo do presente trabalho.

 

MATERIAL E MÉTODO

Amostras de Urina

As amostras de urina foram obtidas de indivíduos não expostos e de expostos ocupacionalmente ao 1,1,1- tricloretano, utilizado no desengraxamento de moldes para fabricação de objetos de espuma. As amostras dos trabalhadores expostos foram colhidas no final do quarto dia da semana de trabalho, acondicionadas em frascos de polietileno e conservadas sob refrigeração a 4oC.

Soluções e Reagentes

- solução padrão de TCA a 0,1% em água;

- solução de KOH 7,8 N;

- piridina;

- tolueno;

- ácido sulfúrico 3,0 M;

- trifluoreto de boro em metanol, 14%.

Aparelhos e Acessórios

- espectrofotômetro Bausch&Lomb, modelo Spectronic 88;

- cromatógrafo a gás "Instrumentos Científicos CG Ltda", modelo 370 equipado com:

· detector de captura eletrônica, fonte de63 Ni;

· coluna OV 17-3% , de vidro silanizado, suporte Chromossorb W-HP 80-100 mesh, de 1,8 m x 3 mm;

· amplificador e registrador Sargent Welch;

· microsseringa Hamilton de 10 µl.

O método utilizado para determinação espectrofotométrica de TCA foi o de Imamura e Ikeda12 (1973), sem modificações. Foram preparadas soluções padrão de TCA a 0,1% em água e em urina para o preparo da curva de calibração, estudo da recuperação e precisão intrasérie do método. Todas as análises foram realizadas no mínimo em quintuplicata.

Adotou-se o método de Ehrner-Samuel e col.7 (1973), com pequenas modificações, para a determinação cromatográfica de TCA. Foi utilizado 0,5 ml de urina, diluída na proporção de 3:2 com água, acidificada com 0,15 ml de H2SO4 3,0 M e extraída com 8,0 ml de tolueno. Após agitação (4 min), 2,0 ml da fase orgânica foram incubados a 80oC com 0,2 ml de trifluoreto de boro 14% em metanol por 60 min. Após a metilação, adicionou-se 1,0 ml de água destilada e 2,0 ml da fase orgânica foram injetados no CG.

Para a otimização das condições de análise cromatográfica foram estudados: fluxo ótimo do gás de arraste; temperatura de operação e a linearidade de resposta do detector. A identificação do TCA foi feita com base na distância de retenção determinada pela injeção, por dez vezes consecutivas, de solução padrão de TCA 4 µg/ml, tratadas como descrito acima; sua quantificação, com base na área do pico calculada por triangulação na metade da altura do pico, foi comparada às áreas obtidas dos extratos das soluções-padrão de TCA em água (representadas pela equação de regressão linear da curva de calibração). Para o estudo da recuperação, precisão e limite de detecção do método, todas as amostras foram analisadas, no mínimo, em quadruplicata.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Método Espectrofotométrico

A curva de calibração foi construída a partir de concentrações de 2,5-5,0-10,0-20,0-40,0-80,0 µg TCA/ml em água e urina, como ilustra a Figura 1. As equações das retas obtidas foram y = 0,0071x - 0,0001 (r = 0,9999) e y = 0,0069 x - 0,0039 (r = 0,9999), respectivamente, para os adicionados em água e urina.

 

 

A Tabela 1 mostra os resultados obtidos no estudo da precisão do método, quando amostras de urina enriquecidas com concentrações de 10, 40 e 80 µg de TCA/ml foram analisadas pelo método de Imamura e Ikeda12 (1973), num total de 5 para cada concentração.

 

 

Esse método permite a determinação não só do TCA como do tricloretanol e de ambos conjuntamente como triclorocompostos totais. Observa-se, no entanto, a necessidade de se utilizar um branco de reativos já que a piridina, por formar hidratos que apresentam cor mesmo na ausência de TCA, interfere na quantificação. Como este fato foi observado mesmo no solvente de grau p.a., procedeu-se à purificação da piridina por destilação, sob refluxo, com pastilhas de KOH, evitando-se, assim, a presença de cor no branco de reativos.

A correlação entre as duas curvas de calibração (água e urina) realizada apresentou-se plenamente satisfatória para o trabalho proposto. Os resultados obtidos no estudo da precisão do método - % CV médio de 2,26 também foram considerados adequados, concordantes com o método original.

Método Cromatográfico

As condições de trabalho do cromatógrafo a gás usadas na determinação do TCA foram :

a) condições de operação

· temperatura da coluna (TC): 90oC

· temperatura do detetor (TD) : 240oC

· temperatura do vaporizador (TV): 180oC

· fluxo de nitrogênio : 40 ml/min

· sensibilidade: 3 x 10 -9 nA

· compensador de corrente: 10-8

b) distância de retenção do TCA metilado -1,28 + 0,027. A Figura 2 representa um cromatograma CG obtido após a injeção de 2 µl de uma solução de TCA a 2,5 µg/ml, após a metilação.

 

 

A linearidade de resposta do detector-DCE para o TCA foi satisfatória no intervalo de 0,5 a 8,0 µg/ml, apresentando a seguinte equação da reta y = 3,2786 x + 0,4330 (r = 0,9998) ( Fig. 3). Através da curva de calibração, foram quantificadas amostras autênticas contendo TCA.

 

 

A Tabela 2 apresenta os resultados obtidos pelo estudo da recuperação e precisão do método. A recuperação foi obtida por comparação da resposta de adicionados de TCA em urina após extração e derivação, com a obtida de padrões injetados no CG após metilação. O limite de detecção, considerado como duas vezes a linha de base, foi de 150 pg.

 

 

Foram necessárias algumas modificações nas condições de análise cromatográfica para obtenção de respostas adequadas do aparelho de cromatografia gasosa na realização do presente trabalho - TC, TD, TV, fluxo de N2, tipo de coluna e de fonte do detetor - com relação às relatadas por Erhner-Samuel e col.7 (1973).

As técnicas de extração e derivação não exigiram quaisquer modificações para obtenção de resultados satisfatórios: recuperação de 96,6% + 1,15, limite de detecção (150pg) inferior ao encontrado por Ehrner-Samuel e col.7 (1973) (6 ng); maior precisão (CV menor 2%) de que o método original ( CV de 5,2%).

O intervalo linear de resposta do detetor ao derivado metilado do TCA, de 0,5 a 8,0 µg/ml, foi menor do que o relatado por Erhner-Samuel e col.7 (1973), de 3,0 a 100,0 µg/ml, o que provavelmente se deve ao menor limite de detecção obtido no presente trabalho.

Não foi empregado padrão interno ou externo na identificação de TCA, o que, aliás, foi observado na maioria dos trabalhos revisados7, 20, 22, 36, provavelmente, devido a dificuldade em se encontrar substância adequada para tal finalidade.

Ácido Tricloroacético em Urina de Indivíduos Expostos Ocupacionalmente a 1,1,1-Tricloretanol

Os resultados de TCA em urina de indivíduos expostos ocupacionalmente ao 1,1,1-tricloretano, obtidos pelos métodos espectrofotométrico e cromatográfico otimizados, estão apresentados na Tabela 3. Os resultados são expressos com relação a creatinina urinária para minorar as influências da flutuação do volume urinário no decorrer do dia de trabalho na eliminação do TCA, de acordo com a recomendação de alguns autores1, 16.

 

 

Os valores de TCA obtidos pelo método espectrofotométrico, quando cotejados com os obtidos pelo método cromatográfico, não apresentaram diferenças estatisticamente significativas, após a aplicação do teste não paramétrico de Wilcoxon.

O menor limite de detecção do método cromatográfico permitiu a determinação de TCA em todas as amostras, o que não pode ser feito quando do uso do método espectrofotométrico. Este fato não representa vantagem significativa em avaliações de exposição ocupacional, quando os teores obtidos são mais elevados. Entretanto, em avaliações de exposição ambiental e em determinações de valores de referência, a capacidade do método de detectar pequenas concentrações do indicador biológico é de grande importância.

 

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* Baseado na Dissertação de Mestrado de M. F. M. Pedrozo - "Determinação de tricloretanol e ácido tricloracético em urina por espectrofotometria e cromatografia em fase gasosa". São Paulo, 1990, apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo.

Correspondência para / Correspondence to:
Maria de Fátima M. Pedrozo
Rua Cristiano de Souza, 75 - Jd. Leonor - 05658-010 São Paulo, SP - Brasil.

Edição subvencionada pela FAPESP. Processo 95/2290-6.
Recebido em 26.6.1995. Aprovado em 31.10.1995.