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Revista de Saúde Pública

Print version ISSN 0034-8910

Rev. Saúde Pública vol.37 n.1 São Paulo Feb. 2003

http://dx.doi.org/10.1590/S0034-89102003000100016 

Revisão

Review

 

Doença de Chagas crônica: do xenodiagnóstico e hemocultura à reação em cadeia da polimerase
Chronic Chagas' disease: from xenodiagnosis and hemoculture to polymerase chain reaction

Ana Angélica Bulcão Portela-Lindoso e Maria Aparecida Shikanai-Yasuda

Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. São Paulo, SP, Brasil

 

 

DESCRITORES
Doença de chagas, diagnóstico. Trypanosoma cruzi. Xenodiagnóstico. Reação em cadeia por polimerase. Cultura de sangue.
RESUMO
Embora tenham ocorrido aprimoramentos no diagnóstico parasitológico da doença de Chagas crônica, a baixa sensibilidade dos exames indiretos é uma limitação para sua aplicação ao diagnóstico e controle pós-terapêutico. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem seu emprego restrito na rotina diagnóstica pela necessidade de infra-estrutura adequada, facilidade de contaminação e custo elevado. Paralelamente, a variabilidade de resultados pela PCR observados em diferentes regiões do Brasil suscita questões relativas à sua aplicação ao diagnóstico. Sua alta especificidade aponta para sua aplicação como método confirmatório no diagnóstico de pacientes com provas sorológicas duvidosas e como método auxiliar no controle pós-terapêutico da doença crônica em comparação às técnicas sorológicas e parasitológicas. O objetivo do trabalho foi discutir e comparar a aplicação dos métodos moleculares e parasitológicos indiretos no diagnóstico e controle pós-terapêutico da doença de Chagas crônica, com base na literatura publicada no período de 1954-2001.

KEYWORDS
Chagas' disease. Trypanosoma cruzi. Xenodiagnosis. Polymerase chain reaction.

ABSTRACT
Although there has been an improvement in the diagnosis of chronic Chagas' disease, the low sensitivity of indirect parasitological tests is a drawback to its application in diagnosis and post-therapeutic control. Polymerase chain reaction (PCR) has limited use in routine diagnosis due to the need of specific laboratory facilities, common DNA cross-contamination, and high costs. At the same time, the high variability of PCR results found in different regions of Brazil raises some questions concerning its applicability for diagnosis. PCR's high specificity is indicative that it can be used as a confirmation method in inconclusive serology diagnosis as well as an auxiliary method in pos-therapeutic control of chronic Chagas' disease when comparing to serology and parasitological techniques. It is discussed here the applicability of molecular and indirect parasitological methods in the diagnosis and post-therapeutic control of chronic Chagas' disease based on the literature published from 1954 to 2001.

 

 

INTRODUÇÃO

A doença de Chagas, ou tripanosomíase americana, constitui-se em uma das mais importantes endemias do Brasil e da América Latina, estimando-se que haja mais de 16-18 milhões de pessoas infectadas e 120 milhões de pessoas expostas ao risco de adquiri-la em nosso continente.40 No Brasil, o Inquérito Sorológico Nacional realizado em 1975-1980 mostrou 4,2% de prevalência em áreas rurais, passando para 2,7% na população geral do Brasil, elevando-se para 3,1% com a inclusão de São Paulo.1,14

Com a implementação de programas de eliminação do vetor, a situação epidemiológica da doença é de controle em vários países da América Latina. Atualmente Uruguai e Chile e 10 dos 12 estados endêmicos do Brasil são considerados livres da transmissão vetorial da doença.40,63,64,69 Este controle é demonstrado por indicadores entomológicos e pela redução para 0,14% da prevalência de crianças e adolescentes infectados no Brasil64 no período de 1989 a 1997, além da redução da incidência em 96% na faixa etária 7-14 anos no período de 1983 a 1997.40

Em função do controle vetorial com uso de inseticidas, a transmissão, embora ainda a principal, teve sua importância diminuída.52 Os grandes movimentos de migração da zona rural para a urbana ocorridos nas décadas de 70 e 8040,69 e as condições inadequadas de triagens sorológicas de doadores em bancos de sangue apontam a importância da transmissão por via transfusional,42,56 com prevalência de anticorpos variável de 0,2% a 1,2% no País em 1994.42,43 A percentagem de candidatos a doadores com anticorpos contra antígenos de T. cruzi era de 1% a 7% na América Latina e de 1% a 3,2% no Brasil.42,43 Na atualidade tem-se reconhecido um melhor controle da hemoterapia;43,56 a Agência Nacional de Vigilância Sanitária, no seu relatório do ano 2000, mostra um perfil de doadores com prevalência de anticorpos para T. cruzi no Brasil de 0,6%, variando de 0,3% na região Sul a 1% na região do Centro-Oeste.3

A doença de Chagas, por sua evolução crônica com diferentes perfis de morbi-mortalidade nas formas cardíaca e digestiva, tem elevado impacto econômico devido a gastos decorrentes de internação, absenteísmo, licença saúde e óbitos precoces.69

A forma crônica da doença caracteriza-se por baixo nível de parasitemia e alto nível de anticorpos. O diagnóstico laboratorial da doença nesta fase pode ser realizado por diversas técnicas, porém todas com limitações. Os exames parasitológicos indiretos consistem no enriquecimento da amostra de sangue, possibilitando a multiplicação do parasito existente; são exames com 100% de especificidade, mas não podem ser considerados como padrão por terem sensibilidade limitada nessa forma, decorrente da parasitemia baixa e transitória.

Objetivando discutir a aplicabilidade dos exames parasitológicos no diagnóstico da doença de Chagas crônica, realizou-se uma busca na Lilacs/OPAS e no Medline/ National Library of Medicine, das referências de publicações editadas no período de 1954 a 2001 na América Latina, particularmente no Brasil.

 

XENODIAGNÓSTICO

O xenodiagnóstico é um dos exames parasitológicos aplicados à forma crônica, registrando-se positividade entre 9% a 87,5%.6-8,10,15,37,38 Têm sido realizados estudos comparativos com emprego de ninfas de espécies diferentes, visando encontrar a melhor espécie a ser aplicada ao exame.20,44,50

Barreto et al7 (1978), comparando ninfas de Dipetalogaster maximus e Triatoma infestans, observaram 52,3% de triatomíneos infectados da espécie D. maximus e 31% de T. infestans. Borges-Pereira et al9 (1996), comparando Panstrongylus megistus e T. infestans aplicados ao xenodiagnóstico de pacientes chagásicos crônicos, mostraram que os primeiros foram mais sensíveis independentemente de sexo, idade e área de origem. No município de Virgem da Lapa, Minas Gerais, Moreira et al44 (1997) encontraram 26,3% de positividade do exame após 392 aplicações com 20 ninfas de quatro espécies diferentes de triatomíneos (Rhodnius neglectus, P. megistus, T. infestans, Triatoma vitticeps - Tabela 1).

 

 

Cerisola et al20 (1971), na Argentina, verificaram que o rendimento com T. infestans foi maior que com R. prolixus e T. pallidipennis, sugerindo que estes resultados decorriam do fato de T. infestans ser mais prevalente naquela área e de apresentar condições biológicas mais apropriadas no trato digestivo para reprodução de T. cruzi. Um número maior de ninfas aplicadas também gera mais positividade, sem interferência da hora da aplicação do exame.61

Outro fator importante, que pode aumentar a positividade do xenodiagnóstico, é sua repetição. Aplicando 15 ninfas de R. prolixus, Pifano51 (1954), observou aumento de 20% no diagnóstico final comparativamente à hemocultura, com positividade de 31,2%. Castro et al18 (1983), empregando uma série de aplicações, registraram positividade em 69,3% dos pacientes, sendo 41,2% no primeiro exame, 19,5% no segundo e 8,6% no terceiro. Classificando os pacientes segundo o grau de parasitemia, esses autores observaram que a positividade em pacientes com baixa parasitemia elevou-se de 22,8% para 41,1%, no segundo exame, e para 54%, no terceiro exame.18 Com uma série de três xenodiagnósticos em pacientes crônicos, Coura et al24 (1991) observaram 46,3% de positividade, aumentando para 53,2% no segundo exame e para 57,7% no terceiro (Tabela 1).

O emprego da técnica de xenodiagnóstico "in vivo" e "in vitro" tem mostrado resultados similares. Utilizando D. maximus, Santos et al57 (1995) compararam xenodiagnóstico "in vivo" e "in vitro" e observaram 21,1% de positividade com o primeiro e 28,1% com o segundo, havendo aumento para 29,8% com o "in vivo" quando repetido mais duas vezes. Pineda & Luquetti52 (1998) registraram 28% de positividade com xenodiagnóstico "in vivo" e 32% com xenodiagnóstico "in vitro". Reações alérgicas no braço do paciente devido à aplicação do teste, melhor aceitabilidade do paciente, facilidade na coleta e restrições em pacientes com lesão de pele e imunodeprimidos são indicações para o emprego do xenodiagnóstico "in vitro" (Tabela 1).

O emprego rotineiro dessa técnica fica restrito devido sua sensibilidade e limitações outras inerentes à técnica tais como: tempo prolongado para o resultado final de até 90 dias, necessidade de criação de triatomíneos em laboratório, perdas dos insetos durante o período de teste e rejeição do paciente à aplicação repetida do exame ao natural.

 

HEMOCULTURA

O cultivo do sangue ou hemocultura alcança, na forma crônica da doença, 0% a 94% de positividade.6,10,21,23,29,35 Registrou-se maior sensibilidade do método com as seguintes modificações: coleta de maior número de hemoculturas, aumento de volume de sangue para 30 ml, maior tempo de observação, emprego do meio Liver Infusion Tryptose (LIT) e menor tempo entre coleta e processamento da amostra.3,6,23,35,36,48 Dessa forma, Albuquerque et al2 (1972) já observavam 97,4% de positividade com três hemoculturas com 9 ml de sangue para cada coleta em 38 pacientes com doença crônica (Tabela 2).

 

 

Chiari et al23 (1989) mostraram que com alterações como aumento do volume de sangue coletado para 30 ml, retirada imediata do plasma e adição do sedimento ao meio LIT, com conservação a 4°C para posterior processamento, ocorre melhora significativa, com 55% de positividade, comparativamente a 27,5% do xenodiagnóstico. Luz et al35 (1994) registraram sensibilidade de 94% com três exames destacando-se já no primeiro teste 79% de positividade e empregaram o método modificado com três hemoculturas de 30 ml de sangue e processamento imediato do exame, com o tempo máximo de 30 min.

Chiari & Brener21 (1966), obtiveram 31,4% de positividade em xenodiagnóstico e 25,7% em hemocultura de uma amostra de 35 pacientes chagásicos crônicos, chegando a 42,8% com a associação de ambos. Fernandes et al27 (1995) mostraram superioridade da hemocultura com 53,3% de positividade contra 13,3% do xenodiagnóstico. Santos et al58 (1999), comparando xenodiagnóstico realizado com 20 ml de sangue e 40 ninfas da espécie Dipetalogaster e hemocultura com 30 ml, observaram positividade similar com ambas as técnicas: 22,2% e 19,4% de positividade, respectivamente. A associação da hemocultura ao xenodiagnóstico, empregados repetidas vezes, elevam a sensibilidade dessas técnicas. Em estudo de campo, considerando as dificuldades inerentes aos trabalhos em zonas rurais com laboratórios improvisados, a hemocultura surgiu como uma alternativa para melhorar a positividade dos métodos parasitológicos indiretos, porém os dados são variáveis, segundo as condições empregadas.

 

XENODIAGNÓSTICO E HEMOCULTURA EM CO-INFECÇÃO COM HIV

Sensibilidade elevada das técnicas parasitológicas tem sido referida em pacientes co-infectados por cepas de T. cruzi e vírus da imunodeficiência humana (HIV), sem reativação da doença de Chagas, registrando-se 81% de positividade ao xenodiagnóstico.60 A comparação entre portadores de doença de Chagas crônica e pacientes com doença de Chagas co-infectados com o HIV realizada por Perez-Ramirez et al49 (1999), em estudo não randomizado, mostrou positividade mais elevada nos pacientes co-infectados de 74% e de 37% em pacientes com doença de Chagas, não tendo os autores observado diferenças genotípicas nos parasitos isolados em ambos os grupos. Sartori,59 empregando hemocultura e xenodiagnóstico em três momentos, registrou parasitemia total de 80,9% nos pacientes com co-infecção com o HIV em relação a 35,3% nos pacientes com doença de Chagas. Com o emprego do xenodiagnóstico "in vitro", a autora analisou a freqüência de ninfas positivas por exame e observou que uma positividade maior ou igual a 20% sugere maior possibilidade de reativação da doença de Chagas em pacientes co-infectados.

 

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

Recentemente, a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) vem demonstrando elevada sensibilidade na detecção de DNA de T. cruzi em amostras de pacientes com doença de Chagas.11,26,28,30,45,65 Infectando camundongos BALB/c com epimastigotas da cepa Tulahuén, Moser et al45 1989 observaram na PCR, com iniciadores de 188 pares de base (pb), limite de detecção de até 110 fentogramas (fg) sem hibridização e de até 1,1 fg mediante uso de hibridização. Com os mesmos iniciadores, Russomando et al55 (1992) detectaram 55 fg de DNA de T. cruzi extraído de soro de macacos infectados.

Comparando dois pares de iniciadores capazes de amplificar uma seqüência de DNA genômico de 188 pb e do DNA do cinetoplasto de 330 pb, Kirchhoff at al32 (1996) demonstraram melhor sensibilidade dos iniciadores de 188 pb, ao analisar sangue de camundongos infectados com tripomastigotas da cepa Tulahuén, um a 380 dias após infecção.

Variações na sensibilidade da PCR analítica para T. cruzi são encontradas por diversos autores.4,5,45 Aplicando os dois pares de iniciadores acima, a sensibilidade alcançada na PCR analítica, empregando DNA de epimastigotas da cepa Y, foi de 5 fg, o que representa menos de um parasito com os dois pares de iniciadores34 (Tabela 3).

 

 

A PCR tem sido utilizada como alternativa no diagnóstico da doença de Chagas. Os iniciadores de188 pb e os de 330 pb vêm demonstrando sensibilidade de até 100% no diagnóstico da forma crônica5,12,28,31,55,66-68 (Tabela 4). Com o emprego de um outro par de iniciadores, que amplifica 692 pares de base do genoma, denominado BP1/BP2, observou-se 100% de sensibilidade, comparativamente aos métodos sorológicos, em sangue de crianças com doença de Chagas na Argentina62 (Tabela 4).

 

 

A aplicação da hibridização para detecção de DNA, amplificado por PCR no sangue de pacientes, é seguida de aumento de sensibilidade observada à leitura por gel de agarose. Estudos em determinadas regiões endêmicas detectaram em pacientes com reações sorológicas positivas para a doença sensibilidade de 96,5% a 100% na PCR associada à hibridização,5,16,62 conforme Tabela 4. No entanto, na Paraíba, Brito et al12 (1995) observaram apenas 45% de positividade com o emprego concomitante da hibridização. Gomes et al28 (1998), analisando sangue de pacientes com doença crônica, encontraram 50% de positividade na PCR, com iniciadores de 330 pb com aumento para 83,5% ao se empregar a hibridização. Os mesmos autores,29 em 1999, mostraram 83,5% de positividade na PCR, com iniciadores 330 pb em pacientes com doença de Chagas crônica comprovada com reações sorológicas convencionais. Outros autores, no entanto, encontraram em amostras de doadores de sangue, com os mesmos iniciadores, 4,5% de positividade, alcançando 25,7% com o "nested" PCR.54

Esses dados sugerem diferenças regionais, uma das quais seria representada por parasitemia menor e transitória, na forma crônica da doença, conforme a área geográfica estudada. No nordeste, observou-se variabilidade de positividade de exames parasitológicos indiretos e PCR em duas áreas estudadas. No Piauí, em pacientes com doença de Chagas crônica comprovada sorologicamente, verificou-se positividade de 34% ao xenodiagnóstico, 25,7% à hemocultura e 59,5% à PCR.25 No mesmo estudo, na Paraíba, os autores observaram positividade de 13% ao xenodiagnóstico e 44,6% à PCR; a hemocultura não foi realizada. Alguns fatores, que poderiam estar relacionados a tal variabilidade, não informados no trabalho, seriam o tempo de afastamento da área endêmica e a gravidade de formas clínicas. Outro fator residiria na diferença genética dos isolados. Em estudo realizado por Lindoso,34 em 1998, mostrou-se amplificação por iniciadores de DNA de cinetoplasto e genômico em 100% dos parasitos isolados a partir de hemocultura e xenodiagnóstico de pacientes na forma crônica provenientes de várias regiões do Brasil.

 

CONCLUSÃO

Aprimoramento das técnicas de xenodiagnóstico e hemocultura contribuíram para aumentar a sensibilidade desses exames. Até o momento, são considerados como padrão no diagnóstico, particularmente quando as provas sorológicas são inconclusivas, em pacientes imunodeprimidos e no controle pós-terapêutico.

O xenodiagnóstico e a hemocultura têm grande valor quando positivos. Mesmo com os avanços, limitações importantes – como tempo prolongado para o resultado final dos exames e necessidade de grandes quantidades de sangue estendendo-se à manutenção de ninfas no caso do xenodiagnóstico – geram dificuldades na sua aplicação rotineira e em banco de sangue.

As técnicas de PCR e hibridização empregam reagentes e aparelhagem dispendiosa e exigem treinamento especializado, além dos cuidados em função da contaminação das amostras com emprego de controles normais de vários ambientes e em vários momentos da manipulação. O uso da técnica automatizada poderia minimizar esses problemas. Áreas isoladas para extração, manipulação de reagentes e análise de produtos amplificados são essenciais para obtenção de resultados confiáveis. Considerando que a hibridização acresce novos custos e usa material radioativo de difícil manipulação, seu uso é indicado quando a confirmação da especificidade ou o aumento da sensibilidade da PCR são fundamentais.

Uma das aplicações da PCR é o seu emprego em bancos de sangue quando os resultados sorológicos são inconclusivos. Deve-se ressaltar que a freqüência de tais resultados chegou a ser, no início da década de 90, igual ou maior que os positivos, com sérias conseqüências econômicas para os hemocentros e psicossociais, para os portadores dessas alterações.17 Os estudos de PCR em sangue de pacientes com provas sorológicas inconclusivas para a doença de Chagas mostram elevada variabilidade, com 4,3% a 46,2% de resultados positivos.29,54

A PCR apresenta-se como uma alternativa no controle pós-terapêutico pela sua maior sensibilidade frente às provas parasitológicas indiretas por essas terem baixa sensibilidade com resultados negativos e por vezes inconclusivos após tratamento.13,25,29 Infelizmente os registros publicados na maioria das vezes representam cortes transversais após a terapêutica, demonstrando maior sensibilidade da PCR em relação às provas parasitológicas.13,19,33 Considerando as dificuldades para o controle pós-terapêutico na forma crônica da doença com a persistência de anticorpos por longo período após o tratamento, é desejável verificar a contribuição de técnicas quantitativas ou semi-quantitativas na detecção de DNA do parasito,13,19,33 comparativamente às técnicas parasitológicas clássicas, em estudos evolutivos, para se estabelecer o seu papel no controle de eficácia do tratamento.

A análise de custo-efetividade, considerados gastos com material e equipamento, recursos humanos especializados, necessidade de infra-estrutura física adequada, e as características da reação (sensibilidade, especificidade, acessibilidade, risco de contaminação e tempo para liberação do resultado final) sugere as seguintes indicações para a PCR:

• Como prova confirmatória, em pacientes com provas sorológicas inconclusivas;

• No controle pós-terapêutico;

• Em estudos comparativos com novas técnicas sorológicas ou parasitológicas;

• Na detecção do nível de parasitemia em imunodeprimidos por técnica quantitativa visando intervenção terapêutica ou profilática precoce.

 

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Correspondência para/ Correspondence to:
Maria Aparecida Shikanai-Yasuda
Laboratório de Imunologia LIM 48
Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 470 sala 4
05403-000 São Paulo, SP, Brasil
E-mail: dmip.secr@hnet.usp.br

Parte da dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, 1999.

Recebido em 19//1/2002. Reapresentado em 23/7/2002. Aprovado em 2/9/2002